Skip to content

Autoprzeciwciała przeciwko GPIHBP1 jako przyczyna hipertriglicerydemii cd

3 miesiące ago

506 words

Płytki następnie inkubowano przez godzinę w temperaturze 4 ° C z ludzką lipazą lipoproteinową znakowaną V5 (200 ng na studzienkę) (patrz: Metody Sekcja S1 w Dodatkowym dodatku, dostępna w pełnym tekście tego artykułu na). Po przemyciu dodano przeciwciało HRP-V5 w celu ilościowego oznaczenia ilości związanej lipazy lipoproteinowej. Równolegle dodawano kozie antyludzkie IgG znakowane HRP, aby dokumentować wiązanie autoprzeciwciał z GPIHBP1. Obecność GPIHBP1 na płytkach zweryfikowano za pomocą wyznakowanego HRP przeciwciała monoklonalnego 11A12. Jako kontrolę zbadaliśmy zdolność przeciwciała monoklonalnego RE310 do blokowania wiązania lipazy lipoproteinowej z GPIHBP1. Szczegóły dotyczące analiz ELISA podano w sekcjach metod od S2 do S5 w dodatkowym dodatku. Test Western Blot wiązania lipazy lipoproteinowej z GPIHBP1
Komórki wyrażające GPIHBP1 znakowane S-białkiem inkubowano z ludzką lipazą lipoproteinową znakowaną V5. Po przemyciu i lizie ekstrakty komórkowe frakcjonowano według wielkości za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), a ilość lipazy lipoproteinowej, która była związana z komórkami, określano w analizie Western blot z użyciem przeciwciała V5. .13 W celu ustalenia, czy autoprzeciwciała GPIHBP1 blokują wiązanie lipazy lipoproteinowej z GPIHBP1, przeprowadzono to samo badanie, z tym wyjątkiem, że transfekowane komórki wstępnie inkubowano z próbkami osocza zawierającymi autoprzeciwciała GPIHBP1. Dodatkowe szczegóły dotyczące testów Western blot są podane w rozdziale S6 w Dodatku Uzupełniającym.
Analiza immunocytochemiczna
Aby zwizualizować wiązanie autoprzeciwciał GPIHBP1, komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) eksprymujące znakowany S białko GPIHBP1 inkubowano przez 2 godziny w 4 ° C z próbkami ludzkiego osocza. Po płukaniu komórki inkubowano ze sprzężonymi z Alex8 Fluor 488 kozimi anty-ludzkimi IgG i IgM przez godzinę w temperaturze 4 ° C, a następnie utrwalano paraformaldehydem. Ekspresję GPIHBP1 oceniano stosując przeciwciało monoklonalne RG310 lub przeciwciało przeciw znacznikowi białka S.
Aby przetestować zdolność autoprzeciwciał GPIHBP1 do blokowania lipazy lipoproteinowej, komórki transfekowane GPIHBP1 znakowane białkiem S inkubowano przez godzinę w 4 ° C z próbkami ludzkiego osocza. Po przemyciu komórki inkubowano przez godzinę w 4 ° C z ludzką lipazą lipoproteinową znakowaną V5. Po przemyciu i utrwaleniu metanolem komórki wybarwiono kozim przeciwciałem IgG i IgM skoniugowanym z Alexa Fluor 488, króliczym przeciwciałem przeciwko znacznikowi białka S, a następnie sprzężonym z Alexa Fluor antygenem osiki IgG o liczbie kopii 647 i Alexa Fluor 555 Skoniugowane mysie przeciwciało anty-V5. Szczegóły eksperymentu podano w rozdziałach Metody S7 i S8 w dodatkowym dodatku.
Wyniki
Interferencja ELISA i autoprzeciwciała GPIHBP1
W teście ELISA typu sandwich poziomy GPIHBP1 w kontrolnych próbkach osocza mieściły się w zakresie od 239 do 1110 pg na mililitr, wartości, które były znacznie wyższe niż u dwóch pacjentów z homozygotyczną mutacją GPIHBP1 C89X (3 pg na mililitr w Pacjent 11 i 6 pg na mililitr w Pacjent 15) iu pacjenta z homozygotyczną delecją GPIHBP17 (36 pg na mililitr u Pacjenta 3) (Tabela S1 w dodatkowym dodatku).
Rysunek 1
[hasła pokrewne: kodent głogów, moje sm blog, ocet na świerzb ]

0 thoughts on “Autoprzeciwciała przeciwko GPIHBP1 jako przyczyna hipertriglicerydemii cd”

Powiązane tematy z artykułem: kodent głogów moje sm blog ocet na świerzb